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  • オスミウム固定

    osmium fixation

    [目次:試料作製]

    SEMで生物試料を観察するために行う化学固定法の一種。
    生体膜を構成するリン脂質を固定するために、細胞や生体から摘出した組織を四酸化オスミウム水溶液(濃度1 %程度)に1時間程度浸漬する。
    高濃度の溶液や長時間の浸漬は、タンパク質の破壊や溶解を起こすので、濃度や時間の管理は適切に行う必要がある。カビやキノコの菌糸や胞子は四酸化オスミウム(水溶液濃度2~4%程度)の蒸気中に数時間から一晩程度曝すことでリン脂質を固定する(蒸気固定)。アルデヒドを用いた浸漬固定の後に行われるので後固定とも呼ばれる。

    Osmium fixation is one of chemical fixation methods for scanning electron microscope (SEM) observation of biological specimens.
    To fix phospholipids of biological membranes, cells or tissues extracted from living organisms are immersed in an osmium tetroxide solution (concentration: about 1%) for approximately one hour. If a high-concentration solution is used or the specimen is immersed in the solution for long hours, proteins in the specimen can be destroyed or melted. To prevent this phenomenon, it is required to properly control the concentration of the fixation solution and the time spent for fixation. For mycelia and spores of molds or mushrooms, the phospholipids in the specimen are fixed by exposing them to the vapor of osmium tetroxide (aqueous solution concentration: about 2 to 4%) for several hours to all night (vapor fixation). This chemical fixation method is also called “post-fixation” because the fixation is carried out after the perfusion fixation using aldehyde.

  • 化学固定

    chemical fixation

    [目次:試料作製]

    SEMで生物試料を観察するために、細胞や生体から摘出した組織などを、薬品を用いて生きた状態に近い形態に保持する手法。
    細胞や組織内のタンパク質や脂質などを薬品で化学的に固定する。細胞や組織を直接固定液に浸漬する浸漬固定が広く用いられている。それ以外に、血管系を介して固定液を注入して固定する灌流固定、試料を固定液の蒸気に曝すことで処理する蒸気固定などが用いられている。
    固定する溶液としては、タンパク質をよく固定できるグルタールアルデヒドやパラホルムアルデヒド、リン脂質をよく固定できる四酸化オスミウムなどが広く用いられている。
    固定後は、エタノールで脱水し、エタノールをt-ブチルアルコールに置換後に凍結乾燥、もしくはエタノールで脱水し、酢酸イソアミルに置換後に臨界点乾燥を行い、SEMで観察する。

    Chemical fixation is a method using chemicals to preserve the morphological structure of biological specimens such as cells and tissues extracted from living organisms, by keeping them close to their living states for scanning electron microscope (SEM) observation.
    The method chemically fixes the proteins, lipids, etc., in cells and tissues. Immersion fixation is widely used, in which cells or tissues are directly immersed into a fixation solution. In addition, two other methods are often used: One is perfusion fixation in which a fixation solution is injected into a biological specimen through the vascular system. Another is vapor fixation in which a specimen is exposed to the vapor of a fixation solution.
    Widely-used fixation solutions include glutalaldehyde and paraformaldehyde which can well fix proteins, and osmium tetroxide which can well fix phospholipids.
    After chemical fixation, the specimen is subjected to ethanol dehydration. Then, the ethanol is substituted for t-butyl alcohol and is subjected to freeze drying, or the ethanol is substituted for isoamyl acetate and is subjected to critical-point drying. Finally, the specimen is observed with the SEM.

  • 灌流固定

    perfusion fixation

    [目次:試料作製]

    SEMで動物の組織を観察するために行う化学固定法の一種。
    麻酔がかかっている状態の動物に心臓から固定液を注入し、血管を介して全身の組織を固定する。
    固定する溶液としては、パラホルムアルデヒド水溶液(濃度4.0 %程度)やグルタールアルデヒド水溶液(濃度1.0~2.5 %程度)を用いる。血管を介するため、組織を短時間で均一に固定することができる。さらに、動物が生きている状態から化学固定を開始するので、死後の自己融解を最小限に抑え生きた状態に近い形態を保持することができる生きた状態に近い形態を保持することができる。灌流固定後は、さらに十分な固定を行うために、速やかに目的組織を切り出して浸漬固定を行う。灌流固定は動物が死後硬直するまで行い、例えばマウスの場合には固定開始から数分程度である。

    Perfusion fixation is one of chemical fixation methods for scanning electron microscope (SEM) observation of tissues in animals.
    In the method, a fixation solution is injected into the heart of an animal (specimen) undergoing anesthesia. It reaches the tissues through the blood vessels and then the tissues of the animal body are fixed. A paraformaldehyde solution (concentration: about 4.0%) or a glutalaldehyde solution (concentration: about 1.0 to 2.5%) is used to fix the tissues. The tissues can be uniformly fixed in a short time because the fixation solution is carried throughout the tissue through the blood vessels. Furthermore in this method, chemical fixation starts at the living state of the animal, autolysis after death is minimized. Thus, the method can maintain the animal tissues close to their living states. For more stable fixation, the subsequent immersion fixation is carried out after perfusion fixation. Perfusion fixation is performed until the animal suffers rigor mortis. In the case of a mouse, the rigor mortis occurs a few minutes or the perfusion fixation finishes in a few minutes.

  • 固定

    fixation

    [目次:試料作製]

    SEMで生物試料を観察するために、細胞や生体から摘出した組織などを生きた状態に近い形態に保持すること。
    生物は死後の自己融解、さらには生物試料作製過程における脱水や乾燥により変性するため、薬品処理や凍結処理によって、試料を生きた状態に近い形態に保持し、かつSEM観察に耐えられる強度を持たせること。

    Fixation is to preserve the morphological structure of biological specimens such as cells and tissues extracted from living organisms, by keeping them close to their living states for scanning electron microscope (SEM) observation.
    Since the organisms suffer degeneration due to autolysis after dying and due to dehydration or drying in the specimen preparation process, fixation is carried out by chemical treatment or freezing treatment so that the morphological structure of a biological specimen is preserved close to its living state and the specimen has substantial strength against electron-beam irradiation for SEM observation.

  • 固定剤

    fixative

    [目次:試料作製]

    化学固定を行うときに用いられる処理剤。グルタ-ルアルデヒド、パラホルムアルデヒド、四酸化オスミウムなどが代表的な固定剤であり、これらの水溶液を目的に応じて使い分ける。アルデヒド系の固定剤は、主としてタンパクを固定し、四酸化オスミウムは、主としてリン脂質を固定する。この他、四酸化ルテニウム、アクロレインなどが用いられる。

  • 固定絞り

    fixed aperture

    [目次:装置]

    レンズ系の絞りの内、可動式ではなく固定されているものの名称。一般に孔径が大きく、分解能に関する限り重要度は若干低い。

  • 固定法

    fixation methods

    [目次:試料作製]

    SEMで生物試料を観察するために、細胞や生体から摘出した組織などを生きた状態に近い形態に保持する手法。生物試料の固定法は、タンパク質や脂質等を薬品で化学的に固定する方法と、組織や細胞内の水分を凍結して物理的に固定する方法の2つに大別される。
    化学固定に広く用いられているのは、細胞や組織を直接固定液に浸漬する浸漬固定である。その他に、動物の場合には血管系を介して固定液を注入して固定する灌流固定、カビの場合には試料を固定液の蒸気に曝すことで固定する蒸気固定などがある。
    物理固定に広く用いられるのは、組織を液体窒素、液体エタンなどに直接浸漬して凍結する浸漬法である。その他に、液体窒素、液体ヘリウムなどで冷却した金属に組織を圧着し凍結する金属圧着法、凍結時に高圧をかけて液体窒素で凍結する高圧凍結法がある。

    Methods to preserve the morphological structure of biological specimens such as cells and tissues extracted from living organisms, by keeping them close to their living states for scanning electron microscope (SEM) observation.
    The fixation methods are classified into chemical fixation and physical fixation. The former method chemically fixes proteins, lipids, etc., by using chemicals and the latter method physically fixes water in cells or tissues by freezing them.
    For chemical fixation, immersion fixation is widely used, in which cells or tissues are directly immersed into a fixation solution. In addition, two other methods are often used: One is perfusion fixation used for animals, in which a fixation solution is injected into a specimen through the vascular system. Another is vapor fixation used for mold, in which the specimen is exposed to the vapor of a fixation solution.
    For physical fixation, immersion freezing is widely used, in which tissues are directly immersed into liquid nitrogen or liquid ethane. In addition, two methods are often used: One is metal mirror freezing (slam freezing), in which a tissue is punched against a metal block cooled by liquid nitrogen or liquid helium. Another is high-pressure freezing, in which a tissue is frozen at the liquid nitrogen temperature while high pressure is applied.

  • 浸漬固定

    immersion fixation

    [目次:試料作製]

    SEMで生物試料を観察するために行う化学固定法の一種で、最も一般的に用いられている。
    細胞や生体から摘出した組織などを直接固定液に浸漬することで、タンパク質やリン脂質を固定する。まず、タンパク質を固定するために、パラホルムアルデヒド水溶液(濃度4.0 %程度)やグルタールアルデヒド水溶液(濃度1.0~2.5 %程度)に1時間以上浸漬する(前固定)。パラホルムアルデヒドは試料への浸透速度が速く、グルタールアルデヒドは固定力が強いので、両者の混合液を使用することが多い。生体から摘出した組織の場合、固定液の浸透を良くするために小さく切り出し(5mm角以下)、緩衝液で洗浄した後、速やかに固定液に浸漬する。次に、生体膜を構成するリン脂質を固定するために、四酸化オスミウム水溶液(濃度1 %程度)に1時間程度浸漬する(後固定)。
    四酸化オスミウムは、試料への浸透速度が遅く、またタンパク質を破壊してしまうため、浸透速度が速くタンパク質を固定するアルデヒド固定を先に行う。

    Immersion fixation is one of chemical fixation methods for scanning electron microscope (SEM) observation of biological specimens. The method is most widely used for chemical fixation.
    In the method, the specimens such as cells and tissues extracted from living organisms are directly immersed into a fixation solution, and proteins or phospholipids in the specimens are fixed.
    First, to fix proteins, the specimens are immersed in a paraformaldehyde solution (concentration: about 4.0%) or a glutalaldehyde solution (concentration: about 1.0 to 2.5%) for one hour or longer (pre-fixation). Since paraformaldehyde has high penetration rate into the specimen and glutalaldehyde has high fixation strength, a mixed solution of both chemicals is used in many cases. (For tissues extracted from living organisms, they are cut into small pieces (5 mm square or less) to improve the penetration of the fixation solution. After washing them in a buffer solution, they are rapidly immersed in the fixation solution.) Next, to fix phospholipids of biological membranes, the specimens are immersed in an osmium tetroxide solution (concentration: about 1.0%) for approximately one hour (post-fixation).
    It should be noted that the fixation of the proteins by aldehyde (high penetration rate) is carried out in advance of the fixation of the phospholipids because osmium tetroxide has low penetration rate into the specimen and can destroy the proteins.

  • 蒸気固定

    vapour fixation

    [目次:試料作製]

    SEMでカビやキノコの菌糸や胞子を観察するために行う化学固定法の一種。
    固定液に浸漬すると、菌糸の変形や胞子の流失が起こるため、固定液の蒸気に曝すことで、菌糸や胞子の生体膜を構成するリン脂質を固定する。固定液には四酸化オスミウム水溶液(濃度2~4%程度)を用い、密閉した容器内に充満した四酸化オスミウムの蒸気で固定を行うため、固定時間は数時間から一晩程度を要する。

    Vapor fixation is one of chemical fixation methods for scanning electron microscope (SEM) observation of mycelia and spores of molds or mushrooms.
    When immersed in a fixation solution, mycelia suffer deformation and spores suffer outflow. To avoid these phenomena, the specimen is exposed to the vapor of a fixation solution, and the phospholipids of the biological membranes of the mycelia and spores are fixed. The fixation solution used is an osmium tetroxide solution (concentration: about 2 to 4%). Since the fixation is carried out in the vapor of osmium tetroxide filled in a closed container, several hours to all night are needed for the fixation.

  • 物理固定

    physical fixation

    [目次:試料作製]

    SEMで生物試料を観察するために、細胞や生体から摘出した組織などを凍結して生きた状態に近い形態に保持する手法。
    細胞や組織内の水分を凍結して物理的に固定する。凍結速度が遅いと細胞内に氷晶ができて細胞内構造を破壊するため、急速凍結や高圧凍結を用いる。急速凍結では、試料を液体窒素、液体エタンなどに直接浸漬して凍結する浸漬法や、液体窒素や液体ヘリウムなどで冷却した金属に試料を圧着する金属圧着法が用いられる。高圧凍結では、数百MPaの圧力下において、液体窒素温度で凍結を行う。
    凍結した試料は、そのままクライオSEM法を用いて観察する場合と、凍結置換および凍結乾燥を行った後に常温で観察する場合がある。

    Physical fixation is a freezing method to preserve the morphological structure of biological specimens such as cells and tissues extracted from living organisms, by keeping them close to their living states for scanning electron microscope (SEM) observation.
    The method physically fixes water in cells or tissues. If the freezing rate is low, ice crystals are formed in the cells and the crystals destroy the cell structure in the cells. To avoid this, rapid freezing or high-pressure freezing is applied. There are two rapid freezing methods available. One is immersion freezing, in which a biological specimen is directly immersed into liquid nitrogen or liquid ethane. Another is metal mirror freezing (slam freezing), in which a biological specimen is punched against a metal block cooled by liquid nitrogen or liquid helium. In high-pressure freezing, a specimen is frozen at the liquid nitrogen temperature under the pressure of a few 100 MPa.
    The frozen specimen is observed with a cryo-SEM while keeping its frozen state, or observed at room temperature with an ordinary SEM after freeze substation and freeze drying.

  • マイクロウェーブ固定

    microwave fixation

    [目次:試料作製]

    マイクロウェーブ照射を併用した生物試料の化学固定法。化学固定を行う際にマイクロウェーブを照射することで、試料中への固定剤の浸透を早めると同時に、反応を促進させることができ、固定時間を短縮することができる。

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