CLEM for Life Science - on chip CLEM -
特長
光学顕微鏡（LM）とTEMの両方で、同一試料台（SiN window chip）に載せた超薄切片試料を観察する手法です。 LM観察とTEM観察の間にTEM試料作製など試料の変形を含む工程がないため、精度が高い重ね合わせが可能です。
on chip CLEMは、TEMで広い視野観察をすることを目的に開発された SiN window chipを使用します。SiN window chipは、専用リテーナーを光学顕微鏡観察用ホルダーに取り付けて、容易に超薄切片試料のLM観察を行なえます。LM観察後、専用リテーナーをTEMホルダーに載せ替えれば、TEMとのシームレスなCLEM観察を行うことができます。
on chip CLEM Workflow（材料）
自家蛍光等のある材料の on chip CLEM
1. 樹脂包埋
試料をエポキシ樹脂等に包埋します
2. 超薄切
ウルトラミクロトームで超薄切片を作製します
切片はSiN window chipにマウントします
３. LM観察
専用リテーナーを光学顕微鏡観察用ホルダーに取り付けて蛍光やSPR（表面プラズモン共鳴）による散乱光等を観察します
４. TEM観察
専用リテーナーをTEMホルダーに載せ替えて、TEM像を取得します
on chip CLEM Workflow（生物試料）
生物試料のための on chip CLEM（金粒子のSPRによる散乱光の利用）
1. 前固定
パラフォルムアルデヒドで固定します
2. 免疫染色（金標識）
標的タンパク質に一次抗体を反応させ、さらにナノゴールドで標識された二次抗体を結合させます
３. 金増感
標識した金の粒径が20nm以上になるように増感します
４. 後固定/樹脂包埋
TEM用の固定（グルタールアルデヒド、四酸化オスミウム）をおこなった後、超薄切できるように樹脂に包埋します
5. 超薄切
ウルトラミクロトームで超薄切片を作製します 切片はSiN window chipにマウントします
6. 染色
酢酸ウラニルとクエン酸鉛による染色をおこないます
7. LM観察
専用リテーナーを光学顕微鏡観察用ホルダーに取り付けて暗視野観察で金のSPR（表面プラズモン共鳴）による散乱光を観察します
8. TEM観察
専用リテーナーをTEMホルダーに載せ替えて、TEM像を取得します
