Volume EM ～三次元再構成～
Volume EM
電子顕微鏡を用いて、試料を三次元再構成し、その内部構造を観察・解析する技術です。電子顕微鏡を用いて三次元観察を行う方法は連続撮影した断面画像を積み重ねて三次元再構成する手法（アレイトモグラフィー法、シリアルブロックフェイス法、FIB-SEM法）と、試料を連続的に傾斜して撮影した投影像を計算処理により、三次元再構成する手法（TEMトモグラフィー法）があります。
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アレイトモグラフィー法
アレイトモグラフィー法とは、樹脂包埋した生物試料などから連続超薄切片を作製後、各切片の同一場所を透過電子顕微鏡 (TEM) または走査電子顕微鏡 (SEM) で観察し、その連続断面画像を積み重ねることにより、三次元観察を行う手法です。
アレイトモグラフィー法 ワークフロー
シリアルブロックフェイス (SBF) 法
樹脂包埋した生物試料ブロック等の表面をダイヤモンドナイフで切削しSEM 観察します。この切削- 観察を繰り返すことにより、厚み方向に連続したSEM像が得られます。この連続SEM像を積み重ねることで三次元再構成します。さらに、目的物 (細胞全体等) を抽出 (セグメンテーション) することで、数百 μmの範囲の三次元構造を明らかにすることができます。
切削- 観察は、SEMの試料室に組み込まれた専用の切削装置により全自動で行うことができます。
* Deerinck, T. J., Bushong, E., Thor, A. & Ellisman, M.H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block-face SEM. Microscopy (Oxf),6-8.(2010)
切削・観察のワークフロー
FIB-SEM法 三次元再構成
FIBによる断面加工とSEM像取得を連続して行います。得られた連続断面SEM像を積み重ねることによって、試料の三次元再構成を行います。重金属染色を行い樹脂包埋した生物試料を観察試料として用います。位置精度が高いことと、加工による歪が小さいこと、少ない切削厚で切削ができること（20nm以下）、そしてダイヤモンドナイフでは切削が難しい歯や骨、金属インプラントといった硬いものも切削できることが特徴です。
TEMトモグラフィー法
TEMで観察する試料の厚さは100 nm以下と薄いものですが、その内部には試料の厚み以下の細かい構造が存在します。TEMトモグラフィー法による三次元再構成は、試料を連続的に傾斜して撮影した投影像を計算処理することによって、試料内部の三次元構造を高分解能で再構成することができます。
