CLEM for Life Science

CLEMとは

CLEM (Correlative Light and Electron Microscopy 光電子相関顕微鏡法) とは、光学顕微鏡 (LM) と、透過電子顕微鏡 (TEM) または走査電子顕微鏡 (SEM)で同じ試料を観察し、それぞれから得られる情報を統合することで、双方のメリットを活かした効果的な観察や分析を行う方法です。

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polish CLEM / milling CLEM

研磨やイオンミリング等により表面に露出させ、LM像 (光学像) と同一視野をSEMで観察する手法です。LMで細胞等の全体像や蛍光染色像を観察後、SEMで同一部位のより細かい細胞内部構造等を観察することが可能です。簡便に広範囲観察ができることが特徴です。専用リンケージホルダを使用すると、位置合わせも容易です。

polish CLEM / milling CLEM ワークフロー

マーカー付ディッシュ等の上で細胞を培養し、前固定、染色をします。LM観察後に後固定、樹脂包埋した試料をホルダーに取付けて座標を確認します。研磨、イオンミリング等により観察面を露出してSEM観察します。

on chip CLEM

光学顕微鏡 (LM) と透過電子顕微鏡 (TEM) の両方で、同一試料台 (SiN window chip) に載せた超薄切片試料を観察する手法です。LM観察とTEM観察の間に試料の変形を含む工程がないため、精度が高い重ね合わせが可能です。材料分野にも使用できます。

on chip CLEM ワークフロー

on chip CLEMは、TEM用に作製した超薄切片をSiN window chipにマウントします。SiN window chipは、専用リテーナーに装着することにより、これを、光顕用ホルダ、TEMホルダに装着することが可能になります。専用リテーナーを光顕用ホルダとTEMホルダに付け替えることで容易にLM・TEM観察を行うことができます。同じ切片を観察できるので精度の高い対応を取ることができます。

この手法が向いているアプリケーション例

• 超薄切片作製後に蛍光や特殊な散乱光が観察できる試料
• 位相差観察等ができる試料
• 生物試料以外にも自家蛍光のあるトナーの粒子や、結晶性のポリマーなどにも応用可能

LLP-CLEM

超広域モンタージュシステムLimitless Panorama (LLP) には、光学顕微鏡など外部で撮影した画像をインポートする機能が搭載されています。LLPではインポートしたLM観察領域と透過電子顕微鏡 (TEM) 像の試料座標を一致させることができます。それぞれの観察像の座標を一致させた後、LMで観察した場所をTEMでモンタージュ撮影することで広い範囲を高解像度で観察できます。

LLP-CLEM ワークフロー

マーカー付ディッシュ等の上で細胞を培養し、前固定、染色をします。LM像を撮影後に後固定、樹脂包埋した試料をマーカーを元に目的の部位を切り出して、ウルトラミクロトームで超薄切片を作製してTEM観察します。撮影していたＬＭ像と低倍像のTEM画像の間で共通する3点以上の特徴点を指定することにより位置合わせを行います。エリアを指定してLLP撮影を行います。

In resin CLEM

In resin CLEMは、試料を蛍光染色・樹脂包埋後、超薄切片を作製し、蛍光を復活させ、同じ切片を光学顕微鏡と電子顕微鏡 (TEM/SEM) で観察する手法です。蛍光の復活には蛍光復活剤 (TUK solution) を用います。同一切片を光学顕微鏡と電子顕微鏡により観察できるため、高精度な光顕像と電顕像の重ね合わせができます。

In resin CLEM ワークフロー

SiN window chip (TEM用) または、平滑な表面を持つSiウエハやスライドグラス (SEM用) に超薄切片を載せます。蛍光復活剤 (TUK solution) 処理を施し、光顕観察、引き続いて電顕観察を行います。

マルチカラーCLEM

有機シリカナノ粒子は様々な修飾が可能で蛍光色素を取り込ませたり、重金属を付加させたりすることができます。蛍光色素と重金属を付加した、有機シリカナノ粒子を細胞等に取り込ませます。複数種の重金属を付加した有機シリカナノ粒子は、EDSマッピングにより、付加された重金属によって識別できます。これにより光顕観察だけでなく電顕観察でもマルチカラー観察することができます。蛍光顕微鏡で観察した部位と同じ部位を電子顕微鏡で詳細観察する際のマーキングとしても利用できます。

マルチカラーCLEM ワークフロー

有機シリカナノ粒子にある標識を付けた「緑蛍光＋金粒子」、「赤蛍光＋鉄粒子」といった修飾をします。これを培養細胞に導入し、蛍光観察とEDSマッピングで同じ場所を確認することができます。