後固定

postfixation

二段階で行われる透過電子顕微鏡用生物試料の化学固定の二段階目の固定で、脂質の保存やコントラストの増強を目的とした固定。
透過電子顕微鏡用の生物試料の作製において、脱水や樹脂包埋が行われる。そのさい、グルタールアルデヒドやパラホルムアルデヒドなどのアルデヒドのみの固定では脂質が固定されておらず、エタノールや有機溶剤の脱水の際に、脂質で構成される膜構造が流出してしまう。またアルデヒドは有機物であり、試料に結合しても、コントラストの増感に関与しない。
これらの問題はアルデヒドによる前固定後に引き続いて行う四酸化オスミウムなどの重金属酸化剤による後固定で解決することができる。四酸化オスミウムは不飽和脂肪酸の二重結合領域に結合し、架橋構造を形成することによって脂質を固定し、脱水の際の脂質の流出、変形を防ぐ。またオスミウムは重金属であるため、結合した領域はコントラストが増強される。このように有用な四酸化オスミウムであるが、浸透が遅い、タンパク質を破壊すると言った欠点があるため、四酸化オスミウムで反応させる前にアルデヒドによるタンパク質の固定(前固定)をする必要がある。

Postfixation is the second-step fixation technique of chemical fixation for biological specimens observed with a TEM. This technique aims at preservation of lipids or enhancement of a TEM image contrast. In the preparation of a biological specimen for TEM observation, dehydration and resin embedding are applied. In these procedures, fixation only with aldehyde (glutaraldehyde, paraformaldehyde, etc.) cannot fix lipids in the specimen. Thus, the membrane structures that consist of lipids flow out of the specimen when performing dehydration with ethanol or an organic solvent. In addition, aldehyde bounded to the specimen does not contribute to the enhancement of the image contrast because it consists of only light elements. These problems are solved by postfixation with heavy metal oxide reagents (osmium tetroxide, etc.) which is a subsequent process of prefixation with aldehyde. Osmium tetroxide fixes lipids by binding it to a double-binding region of unsaturated fatty acid and by constructing a cross-link for preventing outflow and deformation of the lipids. In addition, osmium is a heavy metal, thus enhancing the image contrast of the binding region. Osmium tetroxide is an effective reagent, but it has disadvantages that include slow permeation into the specimen and destruction of proteins in the specimen. To prevent these disadvantageous phenomena, fixation (prefixation) of proteins with aldehyde is required before applying fixation with osmium tetroxide.